大昌华嘉生命科学

肠道类器官动态过程定量成像完整工作流方案

2026年9月18日 · 上海

这套 Protocol 的核心价值，在于将“细胞如何变化”与“细胞终是什么身份”连接起来：先连续成像记录动态过程，再在同一样本上原位固定、多重染色，终将终点标记映射回完整细胞轨迹。

≤120h

长活细胞成像

~2周

完整工作流周期

6阶段

端到端流程

01 完整工作流：六阶段闭环

六阶段串联管线，核心主线贯穿同一样本，大限度保留空间坐标与细胞身份。

样本制备

≥1 d

实验干预

可选

长期活成像

≤5 d

原位固定

2 d

多重染色

1–2 d

追踪与谱系

8 h/类器官

FIG. 1 · PROTOCOL 总览

STEP 1–14

样本制备

Sample preparation

STEP 15–17
STEP 23–25

实验干预

Experimental manipulations

STEP 18–22

长期活成像

Long-term live imaging

STEP 26–33

原位固定与透化

In situ fixation & permeabilization

STEP 34–56

多重抗体染色

Multiplexed antibody staining

STEP 57–82

追踪与谱系重建

Tracking & lineage reconstruction

Fig. 1 | Protocol 总览：六阶段从样本制备到谱系重建的完整流程。第5阶段星号标示不同细胞类型，第6阶段“X”代表固定前死亡的细胞。

样本制备（Steps 1–14）

机械打散类器官，薄层凝胶铺板，4°C 静置沉底。支持 3D 凝胶包埋与 2D 开放腔面两种模型。

长期活成像（Steps 18–22）

共聚焦三维时序采集，≤120 h，12 min/时间点，同时追踪约 20 个类器官。

原位固定与透化（Steps 26–33）

4% PFA 固定，Triton 透化。唯一方向样本架确保固定后重新定位到同一类器官。可暂停存储≤1 个月。

多重免疫染色（Steps 34–56）

elution buffer 洗脱后再染，已验证覆盖肠道全细胞类型抗体面板。

Fig. 3 样本制备与原位固定 — Fig. 3 | 样本制备与原位固定：吸管收窄、铺板方式、固定保留率（中位 77%）、样本架选择与抗体洗脱验证。比例尺：100 μm / 50 μm。

02 实验设计：模型、标记与成像条件

方案成败取决于样本可持续成像、标记足够稳定，以及采集参数不会在数天内累积明显光毒性。

常用荧光标记策略与选型建议：

标记策略	示例	适用场景	注意点
稳定核标记	H2B-mCherry	长期追踪、分裂识别	信号稳定，核形态清楚
稳定膜标记	tdTomato	细胞边界、形态变化	3D 密集组织分割仍困难
短期染料	Hoechst	<24 h 短时实验	可能外排或产生毒性
计算补充	in silico labeling	缺少理想标记时辅助	保留人工核查

Fig. 2 荧光标记成像结果 — Fig. 2 | 荧光标记策略对比：基因编码标记（核/膜）vs 染料/抗体。Z 深度成像质量递减，可靠追踪≤40 μm。比例尺：20 μm / 10 μm / 50 μm。

设计原则

从终点问题倒推成像设计：先决定终点标记和时间分辨率，再选模型、标签和采样频率。药物实验必须含 vehicle 对照。

3D 凝胶包埋模型

原生结构，可观察三维运动，细胞位置稳定。

代价：深层散射限制追踪深度（≤40 μm）。

2D 开放腔面模型

腔面易接触、易处理，成像简单。

代价：结构展平，细胞可能大幅移动。

03 可插入的实验干预

在活成像前或过程中灵活插入，配套对照比较动态表型。

药物处理

加入化合物 + vehicle 对照。如 palbociclib（10 μM）抑制分裂，10–15 h 后效果显现。

激光消融

800 nm 双光子局部破坏特定细胞或界面，观察重排与命运响应。

FRAP

光漂白恢复曲线，定量蛋白表达(α)、降解(δ)和漂白(β)速率。

细胞类型富集

CHIR99021 富集干细胞，IWP-2 诱导分化，DAPT 偏向分泌谱系。

Fig. 4 FRAP 与激光消融 — Fig. 4 | FRAP 动力学模型与恢复曲线 + 激光消融诱导细胞挤出（0–68 min）。比例尺：20 μm / 10 μm。

04 长时成像的质量控制

四个核心控制点决定数据质量与类器官存活。

温度与 CO₂：离开 37°C/5%CO₂ 尽量 <10 min。培养箱湿度>90%，降低气流。
坐标漂移：每日检查位移，使用唯一方向样本架确保固定后回到同一位置。
光毒性：设未成像对照。仅成像组死亡则降激光功率/频率。极端表现：上皮丧失、腔面塌陷。
蒸发：空孔加水。数天内液面、渗透压或 pH 漂移会显著影响类器官健康。

推荐参数　40× 物镜，Z 步进 2 μm，12 min 间隔，线平均 8–16×，可持续成像≥72 h。

Fig. 7 毒性与光毒性 — Fig. 7 | DMSO/乙醇毒性剂量梯度（1–5%）+ 光毒性致类器官死亡全过程（上皮丧失→挤出→塌陷→解体）。比例尺：100 μm / 20 μm。

05 时间线与预期产出

完整流程约两周；预期每轮 10 个类器官，每个 20–30 条谱系。

完整流程的时间安排与关键操作：

时间	阶段	关键操作
≥1 天前	样本制备	打散铺板，4℃ 静置，37℃ 恢复 ≥12 h
第 0–5 天	长期活成像	3D 时序采集，12 min/点，每日检查位置
第 5–7 天	原位固定透化	4% PFA 固定，Triton 透化 ≥2 h
第 7–9 天	多重抗体染色	一抗过夜，多轮洗脱再染
第 9–10 天	终点成像	重新定位同一样本，匹配活成像与染色图像
可变	追踪与谱系重建	检测核 → 连接轨迹 → 识别分裂 → 终点回溯

Fig. 5 活成像与多重抗体染色结果 — Fig. 5 | 3D/2D 类器官连续 4 天活成像 + 固定后多重抗体染色（KRT20、E-cadherin、Lysozyme）。比例尺：30 μm / 50 μm。

06 已验证的终点细胞类型抗体面板

覆盖小鼠小肠类器官全部主要细胞类型。

细胞类型	一抗/染料	谱系归属
增殖细胞	anti-Ki67	干/TA 细胞
分化细胞	anti-KRT20	成熟上皮
干细胞	anti-OLFM4	Lgr5+ 干细胞
Paneth 细胞	anti-lysozyme	分泌谱系
杯状细胞	anti-MUC2	分泌谱系
肠内分泌细胞	anti-CHGA	分泌谱系
Tuft 细胞	anti-DCLK1	罕见分泌
吸收细胞	anti-Aldolase B	吸收谱系

07 优势与局限

客观评估方案适用边界，便于科研人员根据实验需求选择是否采用本套工作流。

✓ 核心优势

同一样本实现动态观察与终点表型闭环
兼容 2D/3D、药物与激光干预
输出单细胞轨迹与谱系树
可扩展至肝、结肠、胰腺及肿瘤类器官
支持多重抗体染色与多种终点分析

！需要注意

需活细胞共聚焦与成像经验
通量低（约 20 个类器官/轮）
追踪结果仍需人工质控
可靠追踪深度≤40 μm
固定过程可能丢失类器官（保留率约 77%）

推荐试点

3–5 个类器官 → 24–48 h 成像 → 原位固定 → 单轮染色 → 小规模轨迹校正，再决定是否扩展到 120 h 和多轮染色。

从这套 Protocol 可以看到，高质量的类器官研究离不开稳定的模型构建与持续的动态观察。大昌华嘉生命科学产品线可为相关研究提供贯穿实验流程的产品支持。

08 推荐产品：从培养到成像的完整方案

CELLINK

3D生物打印设备

构建结构与空间分布更可控的类器官模型

LabPro

活细胞成像系统

连续记录细胞增殖、迁移、分裂及药物响应

DOI：10.1038/s41596-026-01432-z

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大昌华嘉生命科学解决方案，致力于为生命科学领域提供卓越的一站式服务。我们代理众多欧美先进仪器设备，涵盖生物3D打印设备 Cellink、超分辨率显微系统 ONI、Labpro 以及低氧/厌氧控制设备 BakerRuskinn 等。这些高端设备凭借前沿技术，助力科研人员突破传统限制，精准探索生命奥秘。我们深知科研之路充满挑战，因此以专业、高效的服务团队，为用户提供从设备选型、安装调试到售后维护的全方位支持。无论您身处基础研究还是应用开发，大昌华嘉生命科学解决方案都将是您坚实的后盾，全力推动您的科学研究迈向新高度，共同开启生命科学的崭新篇章。

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